10kbまでの一本鎖DNAの調製ができます
Long ssDNA Preparation Kit (LsODN Preparation Kit)
※本製品は特許によって保護されています（特許第7004651号、特許第7305812号）。
製品の特長
- 1,500 base、3,000 baseまたは10,000baseまでの長鎖ssDNAが調製できます。
- 変異や末端の欠失を含まない長鎖ssDNAが得られます。
- 操作は、一般的なdsDNA断片の調製法とほぼ同じで、特別な機器や試薬は必要ありません。
- 製品には、ssDNA専用のゲル抽出キットも付属します。dsDNAと比較して回収率が低いと言われている長鎖ssDNAを高収率・高純度で得ることができます。
長鎖一本鎖DNA調製法の比較
| 増幅原理および手法の名称 | 1 knt ssDNAの変異含有確率 | 備考 | |
|---|---|---|---|
| 化学合成：固相合成 ホスホアミダイト法  |
28.3%～99.995% ※仮に1,000 nt作製した場合の変異含有確率を示した。 |
・高い変異含有確率 ・200 ntまでが実用的な長さ |
|
| in vitro 増幅：PCRベース Asymmetric PCR(非対称PCR)  |
PCR | 0.32% (Q5) 3.01% (Pfu) 59.3% (Taq) |
・PCR増幅(5回)および熱サイクル(30回)での変異 ・PCR可能な長さが作製可能な長さとなる。 ・テンプレート毎、プライマーセット毎に条件を最適化する必要性がある。 |
| 熱サイクル | 4.11% | ||
| プライマー | 1.3%～33.0% 両末端 | ||
| in vitro 増幅：PCRベース Biotin-streptavidin coupling with PCR  |
PCR | 1.57% (Q5) 14.2% (Pfu) 98.9% (Taq) |
・PCR増幅(30回)および熱サイクルによる変異 ・PCR可能な長さが作製可能な長さとなる。 ・二本鎖DNAの混入の可能性の指摘がある。 |
| 熱サイクル | 4.11% | ||
| プライマー | 1.3%～33.0% 両末端 | ||
| in vitro 増幅：PCRベース Exonuclease coupling with PCR  |
PCR | 1.57% (Q5) 14.2% (Pfu) 98.9% (Taq) |
・PCR増幅(30回)および熱サイクル反応による変異 ・PCR可能な長さが作製可能な長さとなる。 ・未消化の二本鎖DNAの混入の可能性。 ・非特異的消化による5’末端の部分消化物の混入の可能性。 |
| 熱サイクル | 4.11% | ||
| プライマー | 1.3%～33.0% 両末端 | ||
| in vitro 増幅：in vitro転写＆逆転写 in vitro transcription and reverse-transcription (ivTRT)  |
転写 ＆逆転写 |
6.1% (M-MuLV RT) 7.2% (AMV RT) |
・逆転写酵素が校正活性をもたないことによる正確性の問題。 ・2 knt長の作製実績の報告がある。 ・逆転写酵素の伸長反応が必ずしもが完結せず、3’末端がヘテロになる場合がある。 |
| プライマー | 0.66%～18.1% 5’末端 | ||
| in vitro 増幅：鎖置換型ポリメラーゼによる線形増幅 Rolling circle amplification (RCA)  |
0.95% (Phi29) 1.49% (Bst) |
・1 kntで0.95%または1.49%と低い変異含有確率 ・同様の方法にて最大長5 kntまたは10 kntまでのssDNAを提供する受託作成メーカーがある。 |
|
| in vivo 増幅：一本鎖DNAファージ Bacteriophage-based ssDNA production  |
0.36% (Drake et al.) 0.46% (Sanjuan et al.) |
・1 kntで0.36%または1.46%と低い変異含有確率 ・M13 phageの場合、インサート長は1 knt以下が望ましい(欠失が起こることから)。 ・ファジミドの場合、インサート長さは数千塩基となるが、ヘルパーファージの由来の一本鎖DNAの混入の指摘がある。 |
|
| in vivo 増幅：プラスミド Nicking method（当社の方法）  |
0.00042% (大腸菌ゲノムと同エラーレート仮定) 0.0042% (その10倍のエラーレートを仮定) 0.042% (その100倍のエラーレートを仮定) ※プラスミドのエラーレートの報告がないことから、大腸菌ゲノムのエラーレートから推測して算出した変異含有確率をあくまでも参考値として示した。 |
・ssDNAをプラスミドから直接切り出すことから、高い正確性が期待できる。 ・ニッキング酵素や制限酵素によって切り出すことから正確で単一な末端が期待できる。 ・10 kntまでが調製可能なキットが提供されている。 ・電気泳動で明確に分離できることから、他の一本鎖DNAのコンタミネーションの心配はない。 |
|
操作方法概略
-
キットに付属のプラスミドに、目的のDNA断片を2つのNicking酵素サイトの間またはNicking酵素サイトと制限酵素サイトの間に入るようにクローニングする。
- 目的DNA断片の両末端のNicking酵素や制限酵素でプラスミドを消化する。
- 消化したプラスミドをDenaturing Gel-Loading Bufferと混合し、変性させた後、アガロースゲルを用いて電気泳動する。
- 目的長鎖ssDNAバンドを切り出し、精製する。
キットに付属するLong ssDNA Gel Extraction Kitを用いた長鎖ssDNA精製例
Long ssDNA Gel Extraction Kitと他社カラムキットとの比較
当社キット(DS640 & DS650)と他社キットA, B, Cとの比較を行った。種々の長さのlssDNA（2μg)をアガロースゲル電気泳動で分離した後、対応するバンドのゲル片を切り出し、各社キットを用いて抽出回収（40μl溶出）した。回収したlssDNA 各16μlを取り、100μlに希釈して吸収スペクトルを測定した（上図）。一方、各5μlを取りアガロースゲル電気泳動を行った（下図）。
両実験結果は、いずれの長さのlssDNAも当社キットを用いた場合の回収率（79％～93%）が最も高いことを示していた。上図の結果から、AとBでは、 lssDNA中にゲル溶解剤GuSCNが混入し、吸収スペクトルによる正確な定量を難しくしていることがわかる。またCには一見ゲル溶解剤の混入は見られないが、NaI（ゲル溶解剤）を用いていることから吸収スペクトルではその混入を追うことはできない。また、アガロースゲル電気泳動の結果（下図）は、当社キットの回収率が高いことを示しているとともに、特に長い6Kbと10kbのlssDNAで分解の程度が軽微であることを示している。
キット内容
#DS615：Long ssDNA Preparation Kit for 1.5 kb
pLSODN-1
pLSODN-2D
Nicked pLSODN-1 (1.5 kb Fragment)
Denaturing Gel-Loading Buffer＊
Long ssDNA Gel Extraction Kit for 3kb＊
#DS625：Long ssDNA Preparation Kit for 3.0 kb
pLSODN-3
pLSODN-4D
Nicked pLSODN-3 (3 kb Fragment)
Denaturing Gel-Loading Buffer＊
Long ssDNA Gel Extraction Kit for 3kb＊
#DS635：Long ssDNA Preparation Kit for 10 kb
pLSODN PCR Template
Denaturing Gel-Loading Buffer＊
λ/HindIII DNA for Long ssDNA Preparation Kit＊
Long ssDNA Gel Extraction Kit for 10kb＊
＊単品販売もあります（下記参照）。
プラスミドの配列データ
DS615：pLSODN-1、pLSODN-2D
DS625：pLSODN-3、pLSODN-4D
DS635：13 kb vector、19 kb vector
※ファイルにはパスワード（Access ID）が設定されております。製品の箱に記載されているAccess IDをご入力ください。
使用文献
#DS615（旧製品コード #DS610）：Long ssDNA Preparation Kit for 1.5kb
#DS625（旧製品コード #DS620）：Long ssDNA Preparation Kit for 3kb
Liu B. et al., Nature Immunol., (2017) 18(5), 499-508.
Xia P. et al., Nature Immunol., (2018) 19(2), 141-150.
Zhu P. et al., Nature Cell Biol., (2018) 20(10), 1134-1144.
Wang Y. et al., J. Hepatol., (2018) 69(4), 861-872.
Zhu P. et al., Nature Immunol., (2019) 02;20(2), 183-194.
Ranawakage D. C. et al., Front Cell Dev. Biol., (2021) 11, 8, 598634.
Eto T. et al,. Sci. Rep., (2021) 11(1), 11770.
Lai S. et al., Sci. Rep., (2022) 12, 8837.
Asamitsu S. et al., Sci. Adv., (2023) 24, 9(8), eade2035.
Morgner J. et al., Dev. Cell., (2023) 10, 58(7), 535-549.
Ohmori I. et al., Neurobiol. Dis., 2024 May 7;15(3):1384-1397.
Nozaki S. et al., J. Bacteriol., (2019) 201(5).
Krishnan V. et al., Biosensors (Basel), (2022) 1, 12(6), 383.
#DS611、#DS612：Denaturing Gel-Loading Buffer
Wei L. et al., Nature Commun., (2021) 1, 12(1), 1591.
Bisia A. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2023 Oct 31;120(44).
#DS640：Long ssDNA Gel Extraction Kit for 3kb
Long ssDNA Preparation Kitの価格
JP
キット構成品の単品販売
BDLはフナコシグループの一員です。
BDL製品をご購入の際は、フナコシ株式会社製品取扱い販売店にご注文ください。
…実験お役立ち情報…
実験に役⽴つTIPSや基本情報をご提供します
